Na stanovenie kvalitatívneho zloženia mnohých potravinárskych produktov sa používa xantoproteínová reakcia na bielkoviny. Prítomnosť aromatických aminokyselín v zlúčenine spôsobí pozitívnu zmenu farby testovanej vzorky.
Čo je to proteín
Nazýva sa aj proteín, ktorý je stavebným materiálom pre živý organizmus. Proteíny udržujú svalový objem, obnovujú poranené a odumreté tkanivové štruktúry rôznych orgánov, či už ide o vlasy, kožu alebo väzy. S ich účasťou sa vytvárajú červené krvinky, reguluje sa normálne fungovanie mnohých hormónov a buniek imunitného systému.
Toto je komplexná molekula, čo je polypeptid s hmotnosťou väčšou ako 6103 d altonov. Štruktúra proteínu je tvorená zvyškami aminokyselín vo veľkých množstvách, ktoré sú spojené peptidovou väzbou.
Štruktúra bielkovín
Výrazným znakom týchto látok v porovnaní s peptidmi s nízkou molekulovou hmotnosťou je ich vyvinutá priestorová trojrozmerná štruktúra podporovaná vplyvmi rôznychstupeň príťažlivosti. Proteíny majú štvorúrovňovú štruktúru. Každý z nich má svoje vlastné charakteristiky.
Primárna organizácia ich molekúl je založená na sekvencii aminokyselín, ktorej štruktúra je rozpoznávaná xantoproteínovou reakciou na proteín. Takouto štruktúrou je periodicky sa opakujúca peptidová väzba -HN-CH-CO- a radikály bočného reťazca aminokarboxylových kyselín sú selektívnou časťou. Práve oni určujú vlastnosti látky ako celku v budúcnosti.
Primárna proteínová štruktúra sa považuje za dostatočne silnú, je to kvôli prítomnosti silných kovalentných interakcií v peptidových väzbách. K tvorbe ďalších úrovní dochádza v závislosti od príznakov stanovených v počiatočnom štádiu.
Vytvorenie sekundárnej štruktúry je možné vďaka skrúteniu sekvencie aminokyselín do špirály, v ktorej sú medzi závitmi vytvorené vodíkové väzby.
Terciárna úroveň organizácie molekuly sa vytvára, keď je jedna časť špirály superponovaná na iné fragmenty, pričom medzi nimi vznikajú všetky druhy väzieb s vodíkovou, disulfidovou, kovalentnou alebo iónovou zlúčeninou. Výsledkom sú asociácie vo forme guľôčok.
Priestorové usporiadanie terciárnych štruktúr s tvorbou chemických väzieb medzi nimi vedie k vytvoreniu konečnej formy molekuly alebo kvartérnej úrovne.
Aminokyseliny
Určujú chemické vlastnosti bielkovín. Existuje asi 20 hlavných aminokyselín,zahrnuté v zložení polypeptidov v rôznych sekvenciách. Patria sem aj vzácne aminokarboxylové kyseliny vo forme hydroxyprolínu a hydroxylyzínu, ktoré sú derivátmi bázických peptidov.
Ako znak xantoproteínovej reakcie rozpoznávania proteínov spôsobuje prítomnosť jednotlivých aminokyselín zmenu farby činidiel, čo naznačuje prítomnosť špecifických štruktúr v ich zložení.
Ako sa ukázalo, všetky sú to karboxylové kyseliny, v ktorých bol atóm vodíka nahradený aminoskupinou.
Príkladom štruktúry molekuly je štruktúrny vzorec glycínu (HNH− HCH− COOH) ako najjednoduchšej aminokyseliny.
V tomto prípade môže byť jeden z vodíkov CH2- nahradený dlhším radikálom vrátane benzénového kruhu, aminoskupiny, sulfoskupiny a karboxyskupiny.
Čo znamená xantoproteínová reakcia
Na kvalitatívnu analýzu bielkovín sa používajú rôzne metódy. Patria sem reakcie:
- biuret s fialovým sfarbením;
- ninhydrín za vzniku modrofialového roztoku;
- formaldehyd s červeným sfarbením;
- Fólia so šedo-čiernou sedimentáciou.
Pri vykonávaní každej metódy sa dokazuje prítomnosť proteínov a prítomnosť určitej funkčnej skupiny v ich molekule.
Existuje xantoproteínová reakcia na proteín. Hovorí sa mu aj Mulderov test. Vzťahuje sa na farebné reakcie na proteínoch, včo sú aromatické a heterocyklické aminokyseliny.
Vlastnosťou takéhoto testu je proces nitrácie cyklických aminokyselinových zvyškov kyselinou dusičnou, najmä adícia nitroskupiny na benzénový kruh.
Výsledkom tohto procesu je tvorba nitrozlúčeniny, ktorá sa vyzráža. Toto je hlavný znak xantoproteínovej reakcie.
Aké aminokyseliny sa určujú
Nie všetky aminokarboxylové kyseliny sa dajú pomocou tohto testu zistiť. Hlavným znakom xantoproteínovej reakcie rozpoznávania proteínu je prítomnosť benzénového kruhu alebo heterocyklu v molekule aminokyseliny.
Z proteínových aminokarboxylových kyselín sa izolujú dve aromatické kyseliny, v ktorých je fenylová skupina (vo fenylalaníne) a hydroxyfenylový radikál (v tyrozíne).
Xantoproteínová reakcia sa používa na stanovenie heterocyklickej aminokyseliny tryptofánu, ktorá má aromatické indolové jadro. Prítomnosť vyššie uvedených zlúčenín v proteíne dáva charakteristickú zmenu farby testovacieho média.
Aké činidlá sa používajú
Na uskutočnenie xantoproteínovej reakcie si budete musieť pripraviť 1% roztok vaječného alebo rastlinného proteínu.
Zvyčajne používajte kuracie vajce, ktoré rozbijete, aby sa ďalej oddelili bielkoviny od žĺtka. Na získanie roztoku sa 1% proteínu zriedi v desaťnásobnom množstve čistenej vody. Po rozpustení proteínu sa musí výsledná kvapalina prefiltrovať cez niekoľko vrstiev gázy. Tento roztok by sa mal skladovať na chladnom mieste.
Reakciu môžete uskutočniť s rastlinným proteínom. Na prípravu roztoku sa používa pšeničná múka v množstve 0,04 kg. Pridajte 0,16 l čistenej vody. Zložky sa zmiešajú v banke, ktorá sa umiestni na 24 hodín na chladné miesto s teplotou asi + 1 ° C. Po dni sa roztok pretrepe, potom sa prefiltruje najprv vatou a potom papierovým skladaným filtrom. Výsledná kvapalina sa uchováva na chladnom mieste. V takomto roztoku je hlavne frakcia albumínu.
Na uskutočnenie xantoproteínovej reakcie sa ako hlavné činidlo používa koncentrovaná kyselina dusičná. Ďalšie činidlá sú roztok 10% hydroxidu sodného alebo amoniaku, roztok želatíny a nekoncentrovaný fenol.
Metodológia
Do čistej skúmavky pridajte 1% roztok vaječného proteínu alebo múky v množstve 2 ml. Aby sa zabránilo vypadávaniu vločiek, pridá sa do nej asi 9 kvapiek koncentrovanej kyseliny dusičnej. Výsledná zmes sa zahrieva, výsledkom čoho je, že zrazenina zožltne a postupne zmizne a jej farba prejde do roztoku.
Keď kvapalina vychladne, pridá sa do skúmavky pozdĺž steny asi 9 kvapiek koncentrovaného hydroxidu sodného, čo je pre proces nadbytok. Reakcia média sa stáva zásaditou. Obsah skúmavky sa zmení na oranžový.
Funkcie
Keďže xantoproteín sa nazýva kvalitatívna reakcia na bielkoviny podpôsobením kyseliny dusičnej, potom sa test vykoná pod pribaleným digestorom. Pri práci s koncentrovanými žieravinami dodržujte všetky bezpečnostné opatrenia.
Počas procesu ohrevu môže dôjsť k vysunutiu obsahu tuby, čo je potrebné vziať do úvahy pri jej upevňovaní do držiaka a výbere sklonu.
Koncentrovaná kyselina dusičná a hydroxid sodný by sa mali užívať iba pomocou sklenenej pipety a gumovej banky, je zakázané písať ústami.
Porovnávacia reakcia s fenolom
Na ilustráciu procesu a potvrdenie prítomnosti fenylovej skupiny sa podobný test vykonáva s hydroxybenzénom.
Do skúmavky vložte 2 ml zriedeného fenolu, potom postupne pozdĺž steny pridajte 2 ml koncentrovanej kyseliny dusičnej. Roztok sa zahrieva, v dôsledku čoho zožltne. Táto reakcia je kvalitatívna pre prítomnosť benzénového kruhu.
Proces nitrácie hydroxybenzénu kyselinou dusičnou je sprevádzaný tvorbou zmesi paranitrofenolu a ortonitrofenolu v percentuálnom pomere 15 až 35.
Porovnanie želatíny
Na dôkaz, že xantoproteínová reakcia na proteín deteguje iba aminokyseliny s aromatickou štruktúrou, sa používajú proteíny, ktoré nemajú fenolovú skupinu.
Do čistej skúmavky vložte 1% roztok želatíny v množstve 2 ml. Pridá sa k nej asi 9 kvapiek koncentrovanej kyseliny dusičnej. Výsledná zmes sa zahrieva. Roztok nezožltne, čo dokazuje absenciuaminokyseliny s aromatickou štruktúrou. Niekedy je možné pozorovať mierne zožltnutie média v dôsledku prítomnosti proteínových nečistôt.
Chemické rovnice
Reakcia xantoproteínu na proteíny prebieha v dvoch fázach. Vzorec prvého stupňa popisuje proces nitrácie molekuly aminokyseliny pomocou koncentrovanej kyseliny dusičnej.
Príkladom je pridanie nitroskupiny k tyrozínu za vzniku nitrotyrozínu a dinitrotyrozínu. V prvom prípade je jeden NO2-radikál pripojený k benzénovému kruhu a v druhom prípade sú dva atómy vodíka nahradené NO2. Chemický vzorec xantoproteínovej reakcie predstavuje interakcia tyrozínu s kyselinou dusičnou za vzniku molekuly nitrotyrozínu.
Proces nitrácie je sprevádzaný prechodom bezfarebnej farby do žltého tónu. Pri vykonávaní podobnej reakcie s proteínmi obsahujúcimi aminokyselinové zvyšky tryptofánu alebo fenylalanínu sa zmení aj farba roztoku.
V druhej fáze interagujú produkty nitrácie molekuly tyrozínu, najmä nitrotyrozín, s hydroxidom amónnym alebo sodným. Výsledkom je sodná alebo amónna soľ, ktorá má žltooranžovú farbu. Táto reakcia je spojená so schopnosťou molekuly nitrotyrozínu prejsť do chinoidnej formy. Neskôr sa z nej vytvorí soľ kyseliny dusičnej, ktorá má chinónový systém dvojitých konjugovaných väzieb.
Takto končí xantoproteínová reakcia na bielkoviny. Druhá rovnicaštádium je uvedené vyššie.
Results
Počas analýzy kvapalín obsiahnutých v troch skúmavkách slúži zriedený fenol ako referenčný roztok. Látky s benzénovým kruhom poskytujú kvalitatívnu reakciu s kyselinou dusičnou. V dôsledku toho sa farba roztoku zmení.
Ako viete, želatína obsahuje kolagén v hydrolyzovanej forme. Tento proteín neobsahuje aromatické aminokarboxylové kyseliny. Pri interakcii s kyselinou nedochádza k žiadnej zmene farby média.
V tretej skúmavke sa pozoruje pozitívna xantoproteínová reakcia na bielkoviny. Záver možno vyvodiť nasledovne: všetky proteíny s aromatickou štruktúrou, či už ide o fenylovú skupinu alebo indolový kruh, spôsobujú zmenu farby roztoku. Je to spôsobené tvorbou žltých nitrozlúčenín.
Uskutočnenie farebnej reakcie dokazuje prítomnosť rôznych chemických štruktúr v aminokyselinách a proteínoch. Príklad želatíny ukazuje, že obsahuje aminokarboxylové kyseliny, ktoré nemajú fenylovú skupinu ani cyklickú štruktúru.
Xantoproteínová reakcia môže vysvetliť zožltnutie pokožky, keď sa na ňu aplikuje silná kyselina dusičná. Mliečna pena získa rovnakú farbu, keď sa s ňou vykoná takáto analýza.
V lekárskej laboratórnej praxi sa táto farebná vzorka nepoužíva na detekciu bielkovín v moči. Je to spôsobené žltou farbou samotného moču.
Xantoproteínová reakcia sa čoraz viac používa na kvantifikáciu aminokyselín, ako je tryptofán a tyrozín v rôznych proteínoch.
