Prietoková cytometria je cytologická výskumná metóda používaná na hĺbkovú analýzu buniek. Jeho výhodou je, že vám umožňuje študovať každú bunku individuálne. Tento typ analýzy pomáha vyhodnotiť niekoľko parametrov v stovkách buniek v priebehu niekoľkých sekúnd. V dôsledku toho sa cytofluorimetria považuje za jednu z najrýchlejších a najpresnejších metód analýzy, ktoré sú v súčasnosti k dispozícii vedcom a lekárom.
Princíp
Princíp prietokovej cytometrie je založený na meraní rozptylu svetla a luminiscencie (fluorescencie) buniek. Bunková suspenzia prechádza ako prúd vysokou rýchlosťou cez bunku cytometra, kde sa ožaruje laserom. Vykonáva sa tam aj takzvané hydrodynamické zaostrovanie. Jeho mechanizmus spočíva v tom, že tok z bunky so študovanými časticami na výstupe prúdi do externého prúdu, ktorý má vyššiu rýchlosť. Výsledkom je, že častice sú zoradené do usporiadaného reťazca.
Predbunky sú označené špeciálnymi fluorescenčnými farbivami (fluorochrómy). Vďaka nim laserový lúčvyvoláva sekundárnu žiaru. Prijaté svetelné signály registrujú detektory. Následne sú informácie spracované pomocou softvérových algoritmov, ktoré umožňujú spočítať jednotlivé populácie buniek, ktoré sa líšia v niektorých kritériách.
Výskum pomocou konvenčnej mikroskopie často nedokáže rozlíšiť medzi rôznymi bunkami, pretože vyzerajú rovnako. Cytofluorimetria môže poskytnúť ďalšie údaje (integritu štruktúry DNA), analyzovať expresiu proteínov, prežitie buniek.
Keďže excitácia fluorochrómov vyžaduje svetelné lúče s rôznymi vlnovými dĺžkami, ako aj rôzne typy detektorov, moderné inštalácie sú vybavené niekoľkými detekčnými kanálmi (od 4 do 30). Počet laserových žiaričov môže byť od 1 do 7. Zložitejšie zariadenia umožňujú viacparametrové štúdie viacerých vlastností častíc naraz.
Výhody a nevýhody
Výhody prietokovej cytometrie zahŕňajú:
- vysoká rýchlosť spracovania (registrácia až 30 tisíc udalostí za 1 sekundu);
- možnosť študovať veľké množstvo buniek (až 100 miliónov vo vzorke);
- Kvantifikácia intenzity fluorescenčného svetla;
- analýza každej bunky;
- simultánne štúdium heterogénnych procesov;
- automatické oddelenie údajov podľa populácií buniek;
- kvalitná vizualizácia výsledkov.
Ďalšou vlastnosťou tejto technológie je, žeanalyzovaná častica môže byť zafarbená niekoľkými fluorescenčnými roztokmi. Vďaka tomu dochádza k viacparametrovej štúdii.
Nevýhody zahŕňajú zložitosť technického vybavenia a potrebu špeciálnej prípravy vzorky.
Cytometre
Prvé zariadenia tohto typu sa objavili už v roku 1968 v Nemecku, no rozšírili sa až oveľa neskôr. V súčasnosti možno všetky prístroje, ktoré pracujú metódou prietokovej cytometrie, rozdeliť na 2 typy:
- zariadenia, ktoré merajú fluorescenčné žiarenie (dve alebo viac vlnových dĺžok), rozptyl svetla 10° a 90° (detektor nízkeho uhla a bočného rozptylu);
- zariadenia, ktoré okrem merania niekoľkých celulárnych parametrov automaticky triedia do skupín podľa týchto kritérií.
Detektor dopredného rozptylu je určený na určenie veľkosti bunky a zariadenie na bočný rozptyl vám umožňuje získať informácie o prítomnosti intracelulárnych granúl, objemovom pomere cytoplazmy a jadra.
Klasické cytometre na rozdiel od svetelných mikroskopov neumožňujú získať obraz bunky. V posledných rokoch sa však vyvinuli kombinované prístroje, ktoré sú schopné spojiť schopnosti mikroskopu a cytofluorimetra. O nich sa bude diskutovať nižšie.
Zobrazovacie cytometre
Pre nástroje používané v klasickej prietokovej cytometrii,jeden znak je charakteristický: ak sú v populácii analyzovaných buniek zaznamenané zriedkavé udalosti, potom neexistuje spôsob, ako posúdiť, aká je ich podstata. Tieto častice môžu byť buď pozostatky mŕtvych buniek, alebo ich vzácna skupina. V konvenčných zariadeniach sú takéto údaje vylúčené zo všeobecného toku udalostí, ale práve ony môžu mať mimoriadnu hodnotu pre vedeckú a klinickú analýzu.
Nová generácia zobrazovacích prietokových cytometrov vám umožňuje zachytiť obraz každej bunky prechádzajúcej v prietoku cez zónu detektora. Je ľahké ho vidieť kliknutím na zodpovedajúcu oblasť diagramu, ktorá sa zobrazí na monitore počítača.
Oblasti použitia
Prietoková cytometria je univerzálna metóda, ktorá sa používa v mnohých oblastiach medicíny a vedy:
- imunológia;
- onkológia;
- transplantológia (transplantácia červenej kostnej drene, kmeňových buniek);
- hematológia;
- toxikológia;
- biochémia (meranie kyslosti vo vnútri bunky, štúdium iných parametrov);
- farmakológia (vytváranie nových liekov);
- mikrobiológia;
- parazitológia a virológia;
- oceanológia (štúdium fytoplanktónu na hodnotenie stavu vodných útvarov a iné úlohy);
- nanotechnológia a analýza mikročastíc.
Imunológia
Ľudský imunitný systém pozostáva zo širokej škály buniek. Prietoková cytometria v imunológii umožňuje hodnotiť ich štruktúru a funkcie, to znamená vykonávať morfofunkčnéanalýza.
Takýto výskum pomáha pochopiť komplexnú povahu imunity. Bunkové fenotypy sa menia v dôsledku aktivácie antigénmi, vývoja patológií a iných faktorov. Cytofluorometria dokáže oddeliť subpopulácie imunitných buniek v komplexnej zmesi a vyhodnotiť všetky ich zmeny v priebehu času.
Onkológia
Jednou z najdôležitejších úloh v onkológii je diferenciácia buniek podľa ich typu. Princíp analýzy prietokovou cytometriou v onkohematológii je založený na nasledujúcom jave: keď je vzorka ošetrená špeciálnym fluorescenčným farbivom, viaže sa na cytoplazmatické proteíny. Po rozdelení v aktívne proliferujúcich bunkách sa jeho obsah zníži na polovicu. V súlade s tým intenzita luminiscencie buniek klesá dvojnásobne.
Existujú aj iné spôsoby, ako odhaliť množiace sa bunky:
- použitie farbív viažucich DNA (propídiumjodid);
- použitie označeného uracilu;
- registrácia zvýšenej hladiny expresie cyklínových proteínov, ktoré sa podieľajú na regulácii bunkového cyklu.
