Chromatografia je jednou z metód separácie látok. Používa sa na následnú kvalitatívnu a kvantitatívnu analýzu fyzikálnych a chemických vlastností mikročastíc. Variantom tejto technológie je afinitná chromatografia. Myšlienka diferenciácie proteínových zlúčenín pomocou vlastnosti molekulárnej afinity je vo vede známa už niekoľko desaťročí. Vývoj sa však dočkal až v posledných rokoch, po zavedení vysoko poréznych hydrofilných materiálov používaných ako matrica. Táto metóda umožňuje riešiť ako analytické problémy (separácia látok a ich identifikácia), tak aj preparatívne problémy (purifikácia, koncentrácia).
Essence
Afinitná chromatografia (z latinského slova affinis - „priľahlý“, „príbuzný“) je založená na afinitných interakciách, ktoré predstavujú vytvorenie vysoko špecifických väzieb medzi molekulou spacera (ligand alebo afinant) a cieľovou molekulou. Tieto mechanizmy sú v prírode rozšírené (spojenie mediátorov alebo hormónov a receptorov, protilátok aantigény, hybridizácia polynukleotidov a iné typy procesov). V medicíne sa afinitná chromatografia používa na praktické účely od roku 1951
Komponenty sú oddelené takto:
- pracovný roztok obsahujúci látku, ktorá sa má izolovať, prechádza cez sorbent;
- ligand uložený na matrici sorbentu zadržiava túto látku;
- je koncentrovaný (akumulácia);
- extrakcia izolovanej látky zo sorbentu premytím rozpúšťadlom.
Táto metóda vám umožňuje izolovať celé bunky. Rozdiel oproti tradičnej sorpčnej chromatografii je v tom, že izolovaná zložka sa silne biošpecificky viaže na sorbent, ktorý sa vyznačuje vysokou selektivitou.
Adsorbenty
Nasledovné látky sa používajú ako adsorbenty:
- Gélové zlúčeniny na báze agarózy, polysacharidu získaného z agaru. Najčastejšie sa používajú 3 odrody: sepharose 4B, CL (cross-linked agarose) a affi-gel. Posledná uvedená kompozícia je modifikovaný gél z agarózy a polyakrylamidu. Má väčšiu biologickú inertnosť, vysokú chemickú a tepelnú odolnosť.
- Silica (silikagél).
- Sklo.
- Organické polyméry.
Na odstránenie mechanických prekážok pri kontakte ligandu sa na jeho oddelenie od nosiča používajú ďalšie látky (peptidy, diamíny, polyamíny, oligosacharidy).
Vybavenie
Zariadenie na afinitnú chromatografiu obsahuje nasledujúce hlavné jednotky:
- skladovacie nádrže pre mobilnú fázu (eluent);
- vysokotlakové čerpadlá pre zásobovanie médiami (najčastejšie piestové);
- filter na čistenie eluentov od prachu;
- dávkovacie zariadenie;
- chromatografická kolóna na separáciu zmesi;
- detektor na detekciu oddelených komponentov opúšťajúcich kolónu;
- zapisovače chromatogramov a mikroprocesorová jednotka (počítač).
Aby sa znížilo množstvo rozpusteného vzduchu, hélium najprv prechádza cez mobilnú fázu. Na zmenu koncentrácie eluentu je nainštalovaných niekoľko čerpadiel riadených programátorom. Chromatografické kolóny sú vyrobené z nehrdzavejúcej ocele (pre zvýšené požiadavky na odolnosť proti korózii), skla (univerzálna možnosť) alebo akrylu. Na preparatívne účely sa ich priemer môže pohybovať od 2 do 70 cm. V analytickej chromatografii sa používajú mikrokolóny Ø10-150 µm.
Na zvýšenie citlivosti detektorov sa do zmesi pridávajú činidlá, ktoré prispievajú k tvorbe látok, ktoré absorbujú viac lúčov v ultrafialovej alebo viditeľnej oblasti spektra.
Metodológia
Existujú 2 hlavné typy kvapalinovej afinitnej chromatografie:
- Kolóna, v ktorej je kolóna naplnená stacionárnou fázou a cez ňu prúdi zmeseluent. K oddeleniu môže dôjsť pod tlakom alebo gravitáciou.
- Tenká vrstva. Eluent sa pohybuje pozdĺž plochej adsorbčnej vrstvy pod vplyvom kapilárnych síl. Adsorbent sa nanáša na sklenenú dosku, keramickú alebo kremennú tyčinku, kovovú fóliu.
Hlavné fázy práce zahŕňajú:
- príprava adsorbentu, fixácia ligandu na nosič;
- privádzanie separačnej zmesi do chromatografickej kolóny;
- zaťaženie mobilnej fázy, viazanie komponentov ligandom;
- výmena fázy na izoláciu viazanej látky.
Destination
Afinitná chromatografia sa používa na izoláciu nasledujúcich typov látok (typ použitého ligandu je uvedený v zátvorkách):
- analógy enzymatických inhibítorov, substrátov a kofaktorov (enzýmov);
- bioorganické látky so znakmi genetickej cudzosti, vírusy a bunky (protilátky);
- sacharidy s vysokou molekulovou hmotnosťou, monosacharidové polyméry, glykoproteíny (lektíny);
- jadrové proteíny, nukleotidyltransferázy (nukleové kyseliny);
- receptory, transportné proteíny (vitamíny, hormóny);
- proteíny interagujúce s bunkovými membránami (bunkami).
Táto technológia sa používa aj na získanie imobilizovaných enzýmov a ich väzba na celulózu umožňuje výrobu imunosorbentov.
Chromatografia proteínov viažucich DNA
Izolácia proteínov viažucich DNA sa vykonáva pomocouheparín. Tento glykozaminoglykán je schopný viazať široké spektrum molekúl. Afinitná chromatografia proteínov tejto skupiny sa používa na izoláciu látok, ako sú:
- faktory iniciácie a predĺženia translácie (syntéza molekúl nukleových kyselín a proteínov);
- restriktázy (enzýmy, ktoré rozpoznávajú určité sekvencie v dvojvláknovej DNA);
- DNA ligázy a polymerázy (enzýmy, ktoré katalyzujú spojenie dvoch molekúl za vzniku novej chemickej väzby a podieľajú sa na replikácii DNA);
- inhibítory serínových proteáz, ktoré hrajú dôležitú úlohu pri imunitných a zápalových procesoch;
- rastové faktory: fibroblast, Schwann, endotel;
- proteíny extracelulárnej matrix;
- hormonálne receptory;
- lipoproteíny.
Dignity
Táto metóda je jednou z najšpecifickejších na izoláciu reaktívnych zlúčenín (enzýmov a väčších agregátov - vírusov). Používa sa však nielen na izoláciu biologicky aktívnych látok.
Detekcia protilátok v malých množstvách, kvantitatívne hodnotenie kyseliny polyadenylovej, rýchle stanovenie molekulových hmotností dehydrogenáz, odstránenie určitých polutantov, štúdium kinetiky aktivácie neaktívnej formy trypsínu, molekulárnej štruktúry človeka interferóny – toto nie je celý zoznam štúdií, v ktorých sa využíva afinita.chromatografia. Použitie na klinike je spôsobené jeho výhodami, ako sú:
- Efektívna čistiaca schopnosťproteíny, polysacharidy, nukleové kyseliny. Mierne sa líšia svojimi fyzikálnymi a chemickými vlastnosťami a strácajú aktivitu počas hydrolýzy, denaturácie a iných typov úprav používaných v iných metódach.
- Rýchlosť separácie látok, dynamický charakter procesu.
- Na stanovenie disociačných konštánt nie je potrebné špeciálne čistenie enzýmov a homogenizácia izoenzýmov.
- Schopný oddeliť širokú škálu látok.
- Nízka spotreba ligandov.
- Možnosť separácie látok vo veľkých objemoch.
- Reverzibilný proces viazania biologických makromolekúl.
Táto technika môže byť kombinovaná s inými, aby sa vytvorilo dodatočné pole (gravitačné, elektromagnetické). To vám umožní rozšíriť technické možnosti chromatografie.
Enzymatické inžinierstvo
Vďaka tejto metóde sa začal aktívny vývoj nového odvetvia biotechnológie - enzýmového inžinierstva.
Afinitná chromatografia na izoláciu enzýmov má nasledujúce výhody:
- získavanie enzýmov vo veľkých množstvách v dôsledku kratšieho času, výsledkom čoho je zníženie ich ceny;
- imobilizácia enzýmov môže výrazne rozšíriť rozsah ich aplikácie v medicíne a priemysle;
- Spojenie enzýmov s nerozpustným pevným nosičom umožňuje študovať vplyv mikroprostredia a smer reakcií, ktoré zohrávajú dôležitú úlohu v prírodných a fyziologických procesoch.
