Kolorimetrická metóda - analýza založená na porovnaní sýtosti farby skúmaných a známych látok. Výsledky fyzikálnych a chemických testov majú veľkú hodnotu pre mnohé odvetvia vedy, no predovšetkým výskum sa využíva v medicíne.
Podstata kolorimetrickej metódy
Existuje mnoho typov testov, ktoré určujú chemické zloženie látok. Niektoré z nich sú univerzálne a sú široko používané v rôznych oblastiach, iné sú špecifické, s vyššou presnosťou. Kolorimetrická metóda je univerzálna.
Podstata analýzy spočíva v tom, že sýtosť farby roztoku s neznámou koncentráciou sa porovnáva s farbou štandardného roztoku. Počas analýzy sa v dôsledku interakcie skúmanej zložky s určitým činidlom vytvorí farebná zlúčenina. Po ukončení reakcie sa výsledný odtieň porovná s farbou roztokov, ktorých koncentrácia je už známa.
Verí sa, že zakladateľom kolorimetrie je Robert Boyle. Použil stláčanietaníny na rozlíšenie železa od medi v roztoku. Bol to Boyle, kto si všimol, že čím väčšia je koncentrácia železa v roztoku, tým bohatší je jeho tón.
Kolorimetria
Kolorimetria je metóda na stanovenie množstva látky v roztokoch. Analýza je založená na Bouguer-Lambert-Beerovom zákone: keď svetelný lúč zasiahne hustú absorbujúcu vrstvu látky, jeho intenzita zoslabne.
Kolorimetrická metóda na určenie koncentrácie látky môže využívať vizuálne porovnanie alebo porovnanie pomocou špeciálnych prístrojov na meranie intenzity farby. Porovnanie sa robí priamym a kompenzačným spôsobom.
- Priamy. Metóda zahŕňa porovnanie úrovne farby testovaného roztoku pri určitej hustote a teplote kvapaliny s referenčným roztokom. Pri použití fotokolorimetrov a spektrofotometrov sa ako referenčný roztok používa destilovaná voda. Prístroje merajú intenzitu prúdu, ktorá závisí od intenzity svetla.
- Kompenzačné. Metóda je založená na privedení farby študovanej vzorky k referenčnej. Výsledok sa dosiahne pridaním rozpúšťadla alebo zvýšením výšky vrstvy zafarbeného média.
Použitie spektrofotometra, monochromátora a iných presných prístrojov ďalej zjednodušuje už aj tak jednoduchú metódu výskumu a umožňuje zvýšiť presnosť výsledkov. Tieto zariadenia sú schopné merať množstvo priepustnosti svetla a určiť vlnovú dĺžku.
Kde sa analýza používa
Kolorimetrická metóda analýzy sa používa, keď je známe presné chemické zloženie, existuje referenčná vzorka na porovnanie a teplota testovacej a referenčnej vzorky je rovnaká. Ak potrebujete rýchlo určiť množstvo farebnej látky, ale je také malé, že nie je možné použiť analytickú metódu.
Kolorimetria sa široko používa v medicíne na klinický biochemický výskum a ďalšie oblasti:
- farmaceutický priemysel;
- potravinársky a alkoholový priemysel;
- agronómia (určenie kvality pôdy).
Pre a proti
Kolorimetrická metóda, ako každá iná, má svoje výhody a nevýhody.
Výhody zahŕňajú nasledovné:
- jednoduchosť analýzy, minimálne prípravné postupy;
- možnosť testovania aj s malým množstvom testovacieho materiálu;
- nie je potrebné drahé vybavenie, hoci v poslednej dobe sa čoraz častejšie používajú moderné zariadenia, ktoré nie sú lacné. Poskytujú však najpresnejší výsledok.
Nevýhody: nízka presnosť analýzy v porovnaní s analytickými metódami.
Biuretova metóda na stanovenie bielkovín
Proteín v krvnom sére je indikátorom stavu homeostázy. Zvýšenie koncentrácie makromolekulárnej zlúčeniny v krvi sa nazýva hyperproteinémia, nízky obsah sa nazýva hypoproteinémia.
Proteíny vkrvné sérum majú iné zloženie, štruktúru, vlastnosti, vykonávajú rôzne funkcie. Delia sa na enzýmy, hormóny, imunoglobulíny a iné. Všetky skupiny proteínov majú množstvo spoločných charakteristík, na základe ktorých boli vyvinuté metódy na stanovenie makromolekulárnych organických zlúčenín v biologických tekutinách.
Zo všetkých metód v klinickej biochémii sa na stanovenie bielkovín najčastejšie používajú kolorimetrické metódy. Sú relatívne lacné, čo je dôležité pre rozpočtové organizácie. a sú celkom jednoduché. Najbežnejšia je biuretová metóda. Podstata metódy: proteíny v alkalickom prostredí reagujú so síranom meďnatým a vytvárajú purpurové zlúčeniny. Obsah bielkovín v krvi je určený saturáciou farbenia. Biomateriál na analýzu sa odoberá ráno na prázdny žalúdok.
Analýza je vysoko presná, ale existujú faktory, ktoré ovplyvňujú koncentráciu bielkovín v krvi:
- fyzická aktivita krátko pred odberom biomateriálu;
- posledné týždne tehotenstva a laktácie;
- užívanie liekov Kortikotropín, Miscleron, Klofibrát zvyšuje obsah bielkovín v krvi a užívanie pyrazínamidu a estrogénu - na zníženie koncentrácie;
- nesprávna poloha ruky počas odberu vzoriek biomateriálu.
Stanovenie železa
Množstvo železa v krvi je jedným z hlavných ukazovateľov pri diagnostike rôznych chorôb. Látka je koncentrovaná v hemoglobíne, ktorý zabezpečuje transport kyslíka do tkanív. Prestanovenie železa kolorimetrickou metódou, najčastejšie sa ako hlavné činidlo používa roztok bathofenantrolínu (0,02 %). Biomateriál - sérum bez stôp hemolýzy.
Podstata metódy: interakciou železnatých iónov a sulfátovaného batofenantrolínu vzniká farebný komplex, ktorého sýtosť sa určuje fotometricky. Na získanie číreho roztoku je potrebné dodržať pravidlá odberu vzoriek biomateriálu, no na presné stanovenie optických hustôt komplexov železo-ligand sa železo uvoľňuje z hemoglobínu pomocou hydroxylamínu a detergentov (dodecylsulfát sodný). Výsledok testu určuje prítomnosť a stupeň patológie. Normálna koncentrácia železa by mala byť:
- 14, 2 – 26,0 µmol/l (muži);
- 10, 6-21, 7 µmol/l (ženy).
Nedostatok železa je zvyčajne spojený so stratou krvi, neadekvátnym príjmom stravy alebo zlou absorpciou z gastrointestinálneho traktu.
Test cholesterolu
Cholesterol je organická látka nachádzajúca sa v bunkovej stene mnohých organizmov vrátane ľudí. Je nevyhnutný pre tvorbu cholekalciferolu a steroidných hormónov. Hladina cholesterolu 3,37-5,2 mmol/l sa považuje za normálnu. Zvýšený obsah je jednou z hlavných príčin aterosklerózy.
Kolorimetrické metódy na stanovenie cholesterolu vám umožňujú rozpoznať cievne ochorenia v počiatočnom štádiu. Podľa patoanatomických výsledkov v letálnom výsledku ischémie je koncentrácia lipofilného alkoholu u pacientovbola 6,5 – 7,8 mmol/l.
Princíp kolorimetrickej metódy spočíva v tom, že cholesterol sa oxiduje 3beta-hydroxy-steroid oxidoreduktázou, pričom sa uvoľňuje peroxid vodíka, ktorý premieňa p-aminoatipyrín na farebnú zlúčeninu. Obsah cholesterolu je určený sýtosťou jeho farby.
Pri vykonávaní testu u dieťaťa je potrebné vziať do úvahy, že koncentrácia cholesterolu v detstve by nemala prekročiť 4,1 mmol / l.
Čo je to enzymatická kolorimetrická metóda?
Enzymatické testy sú založené na použití reakcií enzýmov s vysokou aktivitou. Sú široko používané v analytickej chémii na stanovenie rôznych látok - od dusičnanových iónov až po makromolekuly.
Enzymatické (enzymatické) metódy sú špecifické, umožňujúce analýzu určitých látok v prítomnosti iných látok podobného zloženia. Najbežnejšie metódy založené na použití enzýmu - glukózooxidázy. Test sa používa na stanovenie koncentrácie glukózy v krvi. Presnosť testu umožňuje jeho použitie na úpravu dávkovania hypoglykemických látok u pacientov s diabetom 2. typu.
Metóda oxidácie glukózy sa považuje za jednu z najlepších kvantitatívnych metód na stanovenie glukózy. Ako biomateriál možno použiť krv (kapiláru) aj sérum, ale vhodnejšia je plazma, pretože má nižší obsah hematokritu, čo negatívne ovplyvňuje presnosť výsledku.
Používa sa hlavne kinetická metóda fotometrie. Jeho podstata spočíva v tom, žestanovený pomer glukózooxidázy a peroxidázy, po určitú dobu po začiatku reakcie bude rýchlosť tvorby farebnej zlúčeniny úmerná hladine glukózy vo vzorke. Hlavnou výhodou testu je, že výsledok nie je ovplyvnený prítomnosťou zlúčenín tretích strán vo vzorke. Metóda má aj nevýhodu – na test sú potrebné drahé meracie prístroje od nemeckých alebo švédskych výrobcov.
Záver
Kolorimetrická metóda je presná a ľahko sa používa. Jeho použitie v medicíne umožňuje včasné odhalenie rôznych patologických zmien v organizme. So zavádzaním nových technológií sa metóda zdokonaľuje a stáva sa čoraz populárnejšou.
