PCR alebo polymerázová reťazová reakcia je sofistikovaná laboratórna technika, ktorá sa široko používa v medicíne a iných vedeckých oblastiach. Diagnostika PCR sa svojho času stala skutočným prelomom vo vede.
Popis
Kvantitatívna PCR je typ PCR v reálnom čase.
Tým sa rozumie variant PCR, pri ktorej sa neustále zaznamenáva kinetika reakcie, čo umožňuje kvalitatívne vyhodnotiť obsah špecifických sekvencií nukleotidov DNA v komplexnej molekulárnej zmesi.
Kvantitatívna metóda PCR bude podrobnejšie diskutovaná nižšie.
Podstata analýzy
Na diagnostiku infekcií sa obzvlášť často používajú kultúrne a sérologické metódy. V rámci prvej sa stanovujú protilátky proti infekčnému patogénu v krvnom sére. V druhom prípade sa biologický materiál odobratý od chorého človeka používa na výsev špecifického média, ktoré je priaznivé pre rast kolónií patogénov. Diagnostika v obochprípad môže trvať dni alebo týždne.
Vyšetrenie PCR možno vykonať s rôznymi biologickými materiálmi, ktoré sa získajú od chorého človeka. Krv a iné patologické, fyziologické a biologické médiá a tekutiny pôsobia ako vzorky. Môžete urobiť PCR výkaly alebo moč.
Atypické a vírusové infekcie sa najčastejšie diagnostikujú pomocou kvantitatívnej PCR, pretože ich diagnostika nemusí byť jednoduchá vzhľadom na špecifickú povahu nimi vyvolaného patologického procesu. Na určenie takýchto infekcií je potrebný čas, počas ktorého sa v tele začnú vytvárať protilátky, stanovené sérologickými metódami. To je však v niektorých prípadoch neprijateľné.
Spôsob vykonania
PCR metóda - laboratórna detekcia infekcie vo vzorkách izolovaných od pacienta (in vitro).
Na uskutočnenie polymerázovej reťazovej reakcie je potrebná sada špeciálnych činidiel.
Testovaný materiál sa vloží do skúmaviek s činidlami. Skúmavky sú umiestnené v špeciálnom prístroji - PCR zosilňovači, ktorý je určený na amplifikáciu (zvýšenie počtu) požadovaných RNA alebo DNA fragmentov, PCR zosilňovač pracuje v cyklickom režime. V akomkoľvek cykle, ak vzorky obsahujú sekvenciu RNA alebo DNA patogénu, potom sa v roztoku hromadí stále viac a viac kópií častíc týchto nukleových kyselín. Môžete určiť prítomnosť patogénu a jeho množstvo vo vzorkách.
Typy PCR
Kvalitatívna analýza pomocou PCR vám umožňuje získať nasledujúci výsledok:
- negatívny, keď sa požadovaný patogén vo vzorkách nenachádza;
- pozitívne, ak sa vo vzorkách nájdu sekvencie, ktoré sú charakteristické pre konkrétny patogén.
S pozitívnym výsledkom PCR môžeme s 95% presnosťou hovoriť o prítomnosti diagnostikovanej infekcie. Zároveň presnosť PCR setov používaných na diagnostické účely dosahuje 100 %.
Zvyčajne 5 % nesprávnych výsledkov je podmienených ľudským faktorom. Napríklad porušenie techniky analýzy a skladovania činidiel môže výrazne znížiť presnosť štúdie.
Kvantitatívna PCR definuje koncept vírusovej záťaže. Je možné určiť, koľko súborov DNA patogénu bolo vo vzorkách odobratých pacientovi.
Závažnosť infekcie je priamo úmerná nárastu ich počtu. Môžete tiež určiť úspešnosť terapie na zníženie vírusovej záťaže.
Odoslanie biomateriálu PCR
Kvantitatívna PCR sa vykonáva na klinike hlavne ráno. Počas návštevy lekára bude pacientovi povedané, čo je potrebné vziať: škrabanie, stery, moč alebo krv. PCR dokáže odhaliť patogény bez ohľadu na úroveň kontaminácie materiálu.
Pre pozitívnu analýzu je teoreticky potrebná prítomnosť iba jedného patogénu vo vzorkách. V praxi sa snažia vytvárať ešte priaznivejšie podmienky. Na to existuje niekoľko odporúčaní:
- ak odoberú škrabanie alebo výter z pohlavných orgánovorgány, musíte sa zdržať intímneho styku tri dni pred štúdiom;
- nemôžete sa pred analýzou osprchovať antibakteriálnymi liekmi ani sa umyť;
- tri hodiny pred odberom steru z močovej rúry musíte byť trpezliví a nevyprázdniť črevá.
Pri darovaní krvi sa neriaďte týmito pravidlami.
Ako sa interpretujú výsledky kvantitatívnej PCR analýzy?
Kvantitatívne vyhodnotenie získaných výsledkov
V mnohých klinických situáciách sa objavuje problém účinnosti liečby a/alebo dynamiky patologického procesu. Takéto otázky sú obzvlášť dôležité pri vyšetrovaní ľudí s chronickými infekciami (vírus ľudskej imunodeficiencie, hepatitída B a C). Pri diagnostike vychádzajú zo skutočnosti, že akumulácia amplikónov (produktov PCR) je úmerná prítomnosti kópií požadovaného génu v analyzovanej vzorke.
Samozrejme zohľadňovanie výsledkov kvantitatívnej PCR sa robí gélovou elektroforézou so štúdiom intenzity špeciálnych PCR signálov. Predpokladom správneho kvantitatívneho hodnotenia získaných výsledkov sú tiež pozitívne spoľahlivé kontrolné vzorky obsahujúce známy počet kópií požadovaného génu (napríklad tisíc kópií génu hepatitídy C na jednu PCR reakciu). Niekoľko sériových riedení kvantitatívnej kontroly umožňuje vytvorenie kalibračných kriviek a používa sa na vyhodnotenie obsahu klinických genokópií v klinických vzorkách.
Pri definícii kvantitatívnej PCR bolo kľúčovým úspechom jej vytvoreniefluorescenčné DNA sondy, ktoré sa pridávajú do reakčnej zmesi súčasne s jednoduchými primérmi a umožňujú sledovať proces PCR v čase, čiže real-time PCR.
Metodika TaqMan sa týka syntézy fluorescenčných sond DNA, ktoré sú špecifické pre strednú časť amplikónu a majú dve značky na koncoch. Jedna z nich je fluorescenčná značka, druhá je zhášacia molekula pre túto fluorescenciu.
Špeciálne zariadenie, ktoré je hybridom fluorimetra a termoblokového zosilňovača, vykonáva konštantné merania fluorescencie v každej skúmavke (princíp real-time PCR). Po 20-40 cykloch PCR sa pre každú vzorku získajú individuálne krivky. Počet kópií požadovaného génu, ktorý sa nachádza v testovanej vzorke, možno vypočítať z kalibračných kriviek s kontrolnými vzorkami.
Dôležitou vlastnosťou implementácie PCR fluorescenčnou metódou je aj to, že pri zohľadnení výsledkov nie je potrebné otvárať skúmavky so zmesou PCR. To znižuje možnosť kontaminácie miestnosti amplifikačnými produktmi a nie je potrebné prideľovať špeciálne pracovné oblasti na elektroforézu.
Čo ukazuje kvantitatívny prepis PCR?
Čo sa objavuje?
Prostredníctvom metódy, akou je kvantitatívna PCR, sa zisťujú kvalitatívne zmeny v génoch: inzercie, delécie a bodové mutácie. Ale pri niektorých dedičných poruchách sa zodpovedajúce symptómy objavia ako odpoveď na zmenu v obsahu určitých génov.
ĎakujemKvantitatívna analýza poskytuje číselný výsledok, najčastejšie v IU / ml. To znamená, že v jednom mililitri testovanej vzorky sa našiel určitý počet kópií RNA alebo DNA patogénu, merané v medzinárodných jednotkách.
V závislosti od rozsahu sa diagnostikuje závažnosť infekcie. Krv sa zvyčajne testuje na stanovenie vírusovej záťaže, pretože vírusy sa počas choroby voľne pohybujú v krvi.
Funkcie
Kvantitatívna PCR v krvnom teste má dve funkcie.
- Analýza sa vykonáva v prítomnosti primerov alebo deoxyribonukleozidtrifosfátov, ktoré sú označené fluorescenčnou alebo rádioaktívnou značkou, aby sa presne určil obsah vytvoreného produktu PCR.
- V procese PCR ukončite reakciu skôr, než sa objaví príliš veľa produktov PCR. Je to spôsobené skutočnosťou, že v konečnom štádiu nasýtenia, keď existuje veľa produktov PCR, samotný enzým aj substráty pôsobia ako obmedzujúce články tejto reakcie. Koniec nasledujúceho cyklu PCR za takýchto podmienok už nie je charakterizovaný zdvojnásobením počtu produktov PCR, vyrovnávajú sa nevýznamné kvantitatívne rozdiely medzi rôznymi vzorkami, ktoré sú celkom jasne definované v skorých štádiách po prechode sériou reakčných cyklov..
Náklady na diagnostiku PCR
Výskum PCR má náklady, ktoré závisia od toho, aký druh infekcie sa bude testovať, od metodológie analýzy a testovacieho materiálu. Ak chcete určiť jednu infekciu, budete musieť dať v rámci200-800 rubľov. Pripočítava sa aj poplatok za odber biomateriálu - približne 400 rubľov.
