Rekombinantná DNA sú molekuly vytvorené laboratórnymi technikami genetickej rekombinácie s cieľom kombinovať genetický materiál z viacerých zdrojov. Je to možné, pretože molekuly DNA všetkých organizmov majú rovnakú chemickú štruktúru a líšia sa iba nukleotidovou sekvenciou v nej.
Creation
Molekulárne klonovanie je laboratórny proces používaný na vytvorenie rekombinantnej DNA. Je to jedna z dvoch najpoužívanejších metód spolu s polymerázovou reťazovou reakciou (PCR). Umožňuje vám kontrolovať replikáciu akejkoľvek konkrétnej sekvencie DNA, ktorú si experimentátor vyberie.
Medzi metódami rekombinantnej DNA sú dva zásadné rozdiely. Jedným z nich je, že molekulárne klonovanie zahŕňa replikáciu v živej bunke, zatiaľ čo PCR zahŕňa in vitro. Ďalším rozdielom je, že prvá metóda umožňuje vystrihovanie a vkladanie sekvencií DNA, zatiaľ čo druhá je vylepšená kopírovaním existujúcej objednávky.
Vektorová DNA
Získanie rekombinantnej DNA vyžaduje klonovací vektor. Je odvodený z plazmidov alebo vírusov a je relatívne malým segmentom. Výber vektora na molekulárne klonovanie závisí od výberu hostiteľského organizmu, veľkosti DNA, ktorá sa má klonovať, a od toho, či sa majú exprimovať cudzie molekuly. Segmenty možno kombinovať pomocou rôznych metód, ako je klonovanie reštrikčný enzým/ligáza alebo zostava Gibson.
Klonovanie
V štandardných protokoloch zahŕňa klonovanie sedem krokov.
- Vyberte hostiteľský organizmus a klonovací vektor.
- Získanie DNA vektora.
- Tvorba klonovanej DNA.
- Vytvorenie rekombinantnej DNA.
- Zavedenie do hostiteľského organizmu.
- Výber organizmov, ktoré ho obsahujú.
- Výber klonov s požadovanými DNA inzertmi a biologickými vlastnosťami.
Po transplantácii do hostiteľského organizmu sa cudzie molekuly obsiahnuté v rekombinantnom konštrukte môžu alebo nemusia exprimovať. Expresia vyžaduje reštrukturalizáciu génu tak, aby zahŕňal sekvencie, ktoré sú nevyhnutné na produkciu DNA. Používa ho prekladateľský stroj hostiteľa.
Ako to funguje
Rekombinantná DNA funguje, keď hostiteľská bunka exprimuje proteín z rekombinantných génov. Expresia závisí od obklopenia génu súborom signálov, ktoré poskytujú pokyny na jeho transkripciu. Zahŕňajú promótor, väzbu ribozómov a terminátor.
Problémy vznikajú, ak génobsahuje intróny alebo signály, ktoré pôsobia ako terminátory pre bakteriálneho hostiteľa. To vedie k predčasnému ukončeniu. Rekombinantný proteín môže byť nesprávne spracovaný, poskladaný alebo degradovaný. Jeho produkcia v eukaryotických systémoch sa zvyčajne vyskytuje v kvasinkách a vláknitých hubách. Použitie klietok pre zvieratá je náročné, pretože mnohí potrebujú pevnú nosnú plochu.
Vlastnosti organizmov
Organizmy obsahujúce molekuly rekombinantnej DNA majú zjavne normálne fenotypy. Ich vzhľad, správanie a metabolizmus sa väčšinou nemení. Jediný spôsob, ako preukázať prítomnosť rekombinantných sekvencií, je preskúmať samotnú DNA pomocou testu polymerázovej reťazovej reakcie.
V niektorých prípadoch môže mať rekombinantná DNA škodlivé účinky. To sa môže stať, keď sa jeho fragment obsahujúci aktívny promótor nachádza vedľa predtým tichého génu hostiteľskej bunky.
Použiť
Technológia rekombinantnej DNA sa široko používa v biotechnológii, medicíne a výskume. Jeho proteíny a ďalšie produkty nájdete takmer v každej západnej lekárni, veterinárnej klinike, lekárskej ordinácii, lekárskom alebo biologickom laboratóriu.
Najbežnejšia aplikácia je v základnom výskume, kde je technológia nevyhnutná pre veľkú časť dnešnej práce v biologických a biomedicínskych vedách. Rekombinantná DNA sa používa na identifikáciu, mapovanie a sekvenovanie génov a na ich určeniefunkcie. Sondy rDNA sa používajú na analýzu génovej expresie v jednotlivých bunkách a v tkanivách celých organizmov. Rekombinantné proteíny sa používajú ako činidlá v laboratórnych experimentoch. Niektoré konkrétne príklady sú uvedené nižšie.
Rekombinantný chymozín
Chymozín, ktorý sa nachádza v abomasum, je enzým potrebný na výrobu syra. Bola to prvá geneticky modifikovaná potravinová prísada používaná v priemysle. Mikrobiologicky vyrobený rekombinantný enzým štruktúrne identický s enzýmom získaným z teliat je lacnejší a vyrába sa vo väčších množstvách.
Rekombinantný ľudský inzulín
Prakticky nahradený inzulín získaný zo živočíšnych zdrojov (napr. ošípané a hovädzí dobytok) na liečbu cukrovky závislej od inzulínu. Rekombinantný inzulín sa syntetizuje zavedením génu ľudského inzulínu do baktérií rodu Eterichia alebo kvasiniek.
Rastový hormón
Predpisuje sa pacientom, ktorých hypofýza neprodukuje dostatok rastového hormónu na podporu normálneho vývoja. Predtým, ako bol rekombinantný rastový hormón dostupný, bol získaný z hypofýzy mŕtvych tiel. Tento nebezpečný postup viedol u niektorých pacientov k rozvoju Creutzfeldt-Jakobovej choroby.
Rekombinantný koagulačný faktor
Je to proteín zrážajúci krv, ktorý sa podáva pacientom s formami hemofílie s poruchami krvácania. Nie sú schopní vyrábaťfaktor VIII v dostatočnom množstve. Pred vývojom rekombinantného faktora VIII bol proteín vyrobený spracovaním veľkého množstva ľudskej krvi od viacerých darcov. To prinieslo veľmi vysoké riziko prenosu infekčných chorôb.
Diagnostika infekcie HIV
Každá z troch široko používaných metód na diagnostikovanie infekcie HIV bola vyvinutá pomocou rekombinantnej DNA. Test na protilátky využíva jej proteín. Detekuje prítomnosť HIV genetického materiálu pomocou reverznej transkripčnej polymerázovej reťazovej reakcie. Vývoj testu umožnilo molekulárne klonovanie a sekvenovanie genómov HIV.
